科研丨吉大： 近红外响应型一氧化氮纳米发生器用于增强生物膜清除和针对牙周病的炎症免疫治疗(国人佳作)
科研丨吉大: 近红外响应型一氧化氮纳米发生器用于增强生物膜清除和针对牙周病的炎症免疫治疗(国人佳作)
本研究成功设计了一种三功能NO纳米发生器/ICG NPs，协同aPDT/PTT/气体疗法在牙周病模型中对抗生物膜并抑制炎症。
牙周病是最常见的口腔传染病之一，与许多系统性疾病紧密关联，迫切地需要新型有效的药物。特别是，要解决深层病变定位以及抗菌和抗炎同步的问题。本研究通过将S-亚硝基硫醇(SNO)和ICG加载到介孔二氧化硅包覆的金纳米棒中，实现了近红外(NIR)光触发纳米平台，该平台通过抗菌光动力疗法(aPDT)、光热疗法(PTT)和气体疗法具有抗菌和抗炎双重功能。使用单一808nmNIR光，不但可以通过aPDT诱导的细菌杀灭，还能够最终靠PTT触发的生物膜分散来实现优异的抗菌效果。此外，SNO分子也会被热激活，在牙周病部位释放一氧化氮(NO)气体分子，通过抑制促炎因子和NLRP3炎性小体的组装发挥炎症抑制作用。此外，该纳米平台可以有效地对抗致病性细菌生物膜，调节炎症免疫，从而在牙周病动物模型上获得良好的治疗效果。因此，该设计为解决深层组织治疗问题提供了有效的解决方案，同时具有抗菌/抗炎功能，为牙周病的临床治疗提供了光明的前景，甚至可以扩展到深层部位的其他难治性感染。
译名：近红外响应型一氧化氮纳米发生器用于增强生物膜清除和针对牙周病的炎症免疫治疗
光热剂与红外区吸收相似的光敏剂的组合是实现深部组织aPDT/PTT协同治疗的关键。金纳米材料是最早和最著名的光热剂，目前正处于PTT的临床试验阶段。在前期研究中，我们开发了GNRs和介孔硅的复合结构，实现了肿瘤药物阿霉素的光热控释。在本研究中，我们优化了结构，减小了粒径，使其成为多功能/ICG NPs的主体，如图1A所示。通过典型的种子介导生长过程合成了具有800 nm吸收的GNRs(图S1A)。 NPs分散良好(图S1B)，BET表面积为336.13 m2 g-1，表明具有高载药潜力。孔体积为0.33 cm3 g-1，吸附平均孔宽为3.98 nm(图S2)。SNO分子通过巯基(SH)被包裹在介孔二氧化硅壳的孔隙中，而ICG分子被修饰得到最终产物，与GNR共享808 nm激发光，实现aPDT和PTT的协同效应。对应于图1A的不同阶段NPs TEM图像如图1B所示。GNRs包覆厚度约为13.5 nm的介孔硅， NPs在修饰ICG和SNO分子时保持形态。/ICG NPs的元素组成(Au、Si、O、S、N和Na)通过图1C中的元素映射确定，可以直接观察到元素分布并确认ICG负载。
FTIR光谱如图1D所示，1080 cm-1处的吸收峰可归因于Si-O，2925 cm-1和2854 cm-1处的吸收峰与CTAB中的-CH3和-CH2基团有关。MPTEs修饰后，在2978 cm-1处出现了由-CH2键振动引起的新峰，而在2560 cm-1处出现了由来自MPTES的-SH伸缩振动引起的峰。然而，经过TBN修饰后，-SH伸缩振动几乎消失，并且在1506 cm-1处出现了对应于N=O基团的特征峰，证明了成功的-SNO共轭。、/ICG、和/ICG的紫外可见光谱如图1E所示。纯GNRs的吸收峰在800 nm左右，经介孔SiO2和SNO分子修饰后，红外特征吸收峰蓝移。而加载ICG后，吸收峰再次红移，最终吸收峰固定在780 nm。SNO基团的特定峰出现在350-410 nm，这也证明SNO基团与NPs成功共轭。根据不同浓度游离ICG的紫外可见光谱，在/ICG NPs中，ICG负载能力和包封率分别为8.03%和72.28%(图S3)。此外，进行zeta电位测量以测试GNRs、、和/ICG NPs的电位值，从+ 51.1 mV变为- 18.6 mV，如图1F所示。
GNRs、、和/ICG NPs在808 nm辐照下的光热性质用红外相机测试，如图2A所示。不同阶段NP的红外热图像如图2B所示，颜色越亮代表温度越高。相应的温度曲线 min，最终产物浓度为50 μg mL-1。与PBS相比，GNRs和基于GNRs的NPs表现出非常明显的光热效应。随着照射时间的增加，温度升高，尤其是在前4 min。GNR具有最高的光热效率，是光热效应的主要贡献者。在当前研究中，单个GNR的光热效率可以达到82.15%(图S4)。当GNR被其他材料包裹时，光热效率逐渐降低。在/ICG NPs中，ICG也作为热源，因此相应的温度高于 NPs。此外，光热效应的下降趋势也表明SNO分子的S-N键断裂是吸热的。此外，还探索了单独ICG以调查对PTT的贡献。如图S5A和S5B所示，在前两分钟，温度迅速升高；之后，随着ICG的消耗，温度在接下来的几分钟内保持平衡。照射六分钟后，温度开始下降。有人认为是GNRs PTT效应使/ICG NPs在照射六分钟后温度继续升高。NPs的光热效应呈现出浓度依赖性方式和功率密度依赖性方式，如图1和图2所示。图2D、2E和图S5C和S5D。随着浓度增加到100 μg mL-1，在1 W cm-2下，温度从27 °C快速升高到49.6 °C，持续10 分钟。相比之下，PBS溶液的温度没有明显变化。当功率密度达到2 W cm−2时，温度在10 min内升至51.2 °C。以上结果表明，/ICG NPs可以快速将NIR光转化为热能。此外，众所周知，口腔黏膜的耐受温度通常在55-60 °C左右，因此，当应用这些剂量和辐照强度时(50 μg mL-1 at 1 W cm-2)，没有引起粘膜烧伤或成为口腔癌发生和口腔癌的潜在风险因素的风险。
在生理和病理条件下，龈沟液的pH值对龈沟的结构和功能至关重要。当炎症增加时，通常会发生pH从6.90上升到8.66的情况。由于蛋白质的细菌降解，牙周炎的发展也与龈沟液的pH值升高到8.5左右有关。因此，研究了/ICG NPs在不同pH值(pH=7.0和8.5)下的光热性能，以模拟生理和病理生理条件(图S5E和图S5F)。结果，/ICG NPs溶液在pH= 8.5时表现出更高的光热性能，在近红外照射10 min时温度升至45.7 °C。此外，随着pH值从7.0增加到8.5，NPs的zeta电位值显示出更多的负电荷(图S6)。增加的静电排斥使整个NP溶液在碱性条件下更加稳定。接下来，在图S7中研究了具有不同pH(pH=7.0和8.5)的溶液中的光稳定性和暗稳定性。照射20 min后，两种不同pH值溶液的峰均降低，这归因于ICG消耗。同样，在黑暗环境中，内部NP溶液表现出稳定状态，特别是在pH值为8.5时。然而，在pH值为7.0时，少量的粒子聚集会导致内部NP溶液的吸收峰降低。然而，在外部溶液中没有明显的ICG泄漏，表明/ICG的纳米结构足够稳定，可以减少一些不良的药物泄漏，特别是在碱性微环境中。经过四个周期的间歇性光热实验，每个周期的照射时间为600秒，冷却时间为1100秒，加热-冷却曲线可以重复而没有变化，进一步证明了显著的光热稳定性(图2F)。此外，根据加热-冷却曲线A)、冷却循环拟合曲线B)以及材料和方法中给出的方程，计算出/ICG NPs的光热转换效率为52.76%，是一种极好的PTT光热转换剂。
DPBF可以检测到1O2的产生，其特征吸收峰在410 nm处。为了测试/ICG NPs的PDT性能，对DPBF在808 nm照射后的时间依赖性吸收光谱进行了测试。如图2G所示，在近红外光照射10 min后，由于与单线态氧的特异性反应，DPBF的吸收峰强度降低了约60%。再照射10 min后，DPBF的吸收峰强度几乎完全消失，表明ICG分子具有有效的PDT效应。然后，通过X波段EPR光谱探索ROS的种类和ROS产生的连续性(图S9)。有趣的是，1O2的信号强度在照射5 min后仍保持在较高水平。生成的·OH水平也相对较低。相反，在808 nm激光照射下，/ICG NPs没有检测到O2-信号。
NO分子的释放是由内部GNR的光热效应产生的热量触发的，因此/ICG NPs的NO生成和光热效应可以使用相同的NIR光控制同时发生。通过Griess法测量NO在体外的释放能力。结合图S10A中的NO标准曲线，计算NO的释放量。从图2H可以看出，NO的释放是由NIR光控制的，因为SNO分子可以被GNR和ICG的热量激活。开始时，在808 nm光照射10 min时，迅速产生NO气体，表明SNO分子可被热快速活化并释放NO分子。关闭照射光后，在接下来的10 min内仍有少量NO持续产生，说明NO分子从NPs的介孔SiO2中出来，继续与探测探针发生反应。然后再过10 min，几乎没有检测到NO气体。当再次照射时，NO气体继续产生。这种依赖于近红外辐射的NO释放过程可以重复多次循环，这充分证明了NPs强大的NO生成能力。没有辐照几乎没有释放NO气体，进一步证实了光控NO释放。此外，NO的释放表现出浓度依赖性。随着浓度的增加，NO的产生也增加(图2I)。比较了 NPs和/ICG NPs的NO产生，与相比，/ICG NPs可以在更短的时间内产生更多的NO(图S10B)。因此，在NO分子的释放方面，ICG有重要的贡献，因为除了光热效应，ICG中的ROS还可以与SNO反应，均裂S-N键，所以/ICG NPs的NO释放能力大大增强。此外，通过元素分析仪检测到NO能力。中N元素的含量为0.29%(w%)，-SNO浓度为12.84 μg mg-1。
考虑到/ICG NPs用于临床应用的实用性和可行性，进行了体外和体内生物安全性试验(图S11)。首先，通过RTCA测定评估了NPs对小鼠成纤维细胞系L929的体外细胞毒性。如图S11所示，在浓度为100 μg mL-1的/ICG NPs处理后，细胞活力受到显著抑制。在24 h和72 h时，HGF中的CCK8测定也证实了这种抑制作用(图S11B)。因此，50 μg mL−1的浓度作为后续实验的相对生物安全浓度。此外，/ICG NPs在50 μg mL-1时的溶血结果仅为约0.27%(图S11C)。体重曲线显示各组动物行为和体重没有明显差异(图S11D)。H&E组织学分析显示的体内长期毒性表明，治疗42天后，NPs不会导致心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏等主要器官的组织学异常或局部炎症(图S11E)。因此，新设计的低浓度/ICG NPs在临床应用中具有相对的生物相容性和生物安全性。
牙周炎最初是由龈下菌斑引起的，红色复合物的成员加重了牙周炎。发现橙色和红色复合物的成员在发炎部位周围增加最多。本研究分别选择牙龈卟啉单胞菌(P. gingivalis)和具核梭杆菌(F. nucleatum)作为红色复合体和橙色复合体的代表菌株，形成与牙周病密切相关的单种和多种牙周生物膜模型。在抗生物膜实验开始时，研究了光热效应(图S12)。经过5分钟的照射后，由于双重光热效应，/ICG组的温度升高幅度最大。受-SNO基团的影响，组的温度升高最慢。然后，加载ICG后，/ICG NP组的光热效应得到改善。为了评估/ICG NPs的抗生物膜特性和根除能力，构建了形成和建立的单物种生物膜。图3A描绘了形成生物膜的整个培养过程，并建立了生物膜以供后续测试。图3B-F绘制了/ICG NPs对牙龈卟啉单胞菌生物膜形成的干扰。在图3B中，具有代表性的3D活/死染色图像表明，/ICG组中aPDT和PTT的组合会显著增加整个生物膜中的死菌比例(图3C)，但仅略微阻碍了形成细菌生物膜的生物膜厚度值(图3D)。同时，由于加入了NO发生器SNO，/ICG NPs通过提高杀灭效率和减少生物膜厚度(图3C-D)显示出显著的抗生物膜能力。值得注意的是，发现各组的生物膜厚度呈下降趋势，特别是在和/ICG组中(图3D)。这主要是由于在生物膜形成过程中，aPDT/PTT和NO对细菌细胞膜通透性的改变作用，部分细菌在悬浮状态下被杀死。当细菌细胞膜被破坏时，DNA和RNA等细胞内成分会释放到周围的微环境中，最终导致细菌死亡。/ICG NPs组表现出比任何其他组更高的OD260值，表明细胞内DNA和RNA泄漏更多(图S13)。除aPDT和PTT外，NO的亲脂性和膜通透性使其更容易在脂质双分子层附近积累，随后与细胞内O2-反应诱导氧化应激，导致膜结合蛋白和其他局部蛋白的结构降解，最终导致膜损伤。因此，和/ICG NPs组均表现出NO介导的强膜损伤。由于/ICG NPs产生的ROS可以在同一时间内促进更多的NO释放(图S10B)，因此/ICG NPs表现出最强的膜破坏。图3E-F绘制了牙龈卟啉单胞菌在不同纳米材料作用下形成生物膜的CFU计数。与对照组相比，/ICG组中aPDT和PTT的组合导致减少4-log。然而，与/ICG相比，具有aPDT/PTT/NO协同功能的/ICG组的CFU降低超过1 log。这种CFU减少也能够最终靠和组之间的区别来证实，这表明NO增强了抗生物膜能力。这种现象可能是由NO和ROS的产物活性氮(RNS)引起的。此外，在另一种与牙周炎相关的病原体(具核梭杆菌)中也发现了类似的趋势，即不同纳米材料对生物膜形成的干扰。因此，这种结合aPDT、PTT和NO气体治疗的智能平台具有增强的抗菌效率，可以干扰生物膜的形成，从而有望预防牙周病的复发。
(A)(a)形成生物膜和(b)建立生物膜的实验方案示意图。(B)牙龈卟啉单胞菌生物膜形成的代表性3D活/死图像。(C)牙龈卟啉单胞菌在形成生物膜中的死/活细菌比率。(D)牙龈卟啉单胞菌形成生物膜的平均厚度。(E,F)牙龈卟啉单胞菌生物膜形成的CFU计数。(G)牙龈卟啉单胞菌已建立生物膜的代表性3D活/死图像。(H)已建立的生物膜中牙龈卟啉单胞菌的死/活细菌比率。(I)牙龈卟啉单胞菌已建立的生物膜的平均厚度。(J,K)已建立的牙龈卟啉菌生物膜的CFU计数。第1组：对照；第2组：；第3组：/ICG；第4组：；第5组：/ICG。n = 6，*p 0.05，**p 0.01，***p 0.001，****p 0.0001。
更重要的是，牙周病等细菌引起的疾病主要归因于成熟的生物膜和随后的级联免疫反应。这对于疾病发生后的生物膜根除是至关重要的，并且可以预测延缓或停止病理过程的进展。在本研究中，/ICG在分散牙龈卟啉单胞菌成熟生物膜方面也显示出巨大潜力。如图3G-3I所示，/ICG组的死/活菌比例最高，生物膜厚度最小。从生物膜厚度看，具有协同aPDT/PTT效应的/ICG组的生物膜分散性能低于和/ICG组。这一结果与之前的研究非常一致。单独的ROS产生或热疗，甚至低剂量或功率强度的协同aPDT/PTT组都不足以对成熟生物膜中金黄色葡萄球菌进行致命杀伤。尽管ROS被认为会破坏生物膜组分EPS基质，但已建立的具有防御系统的生物膜可能会消耗部分ROS。在这种情况下，需要更大剂量的光敏剂和更强的功率强度来对抗已形成的生物膜，这可能会导致周围组织的损伤。因此，引入NO等气体疗法以协同辅助aPDT/PTT对抗成熟生物膜显得尤为重要。值得注意的是，产生NO的和/ICG组在深层有更多的死细菌(图S15G-S15K)，证明了生物膜分散的优异能力。尽管NO调节的生物膜扩散机制仍有待阐明，但一种流行的假设是NO通过环二鸟苷酸(c-di-GMP)改变生物膜结构，这有助于生物膜EPS基质的产生和维持。NO通过以下方式降低c-di-GMP水平：刺激负责水解c-di-GMP的磷酸二酯酶的活性，上调活性相关基因，下调粘附素和毒力因子相关基因的表达。对于PDT过程，PDT引起的1O2只能在有限的距离内扩散，从而导致局部杀伤活性。据报道，1O2的扩散距离约为0.01-0.02 µm。而微米级细菌生物膜的厚度远远超过PDT产生的1O2的扩散距离，因此在致密的细胞外基质存在下几乎不会侵入细菌生物膜造成致命伤害。有趣的是，一旦NO产生，整个纳米平台可能会充当纳米马达，促进对生物膜的深度推进以突破生物膜保护屏障。因此，每层纳米颗粒与细菌的接触大大增加，产生了合理均衡的杀灭效果。不仅如此，分散的生物膜变得不再致密，这有利于增强ROS的渗透并获得更好的性能。随后，NO可以与ROS反应形成RNS。这一过程通过脂质过氧化进一步破坏了微生物膜，并加速了细胞完整性的降解。此外，与对照组相比，/ICG组使牙龈卟啉单胞菌生物膜减少了大约2 log CFU(图3J-3 K)。该结果表明，相同的纳米药物在成熟生物膜中的抗菌效率低于形成生物膜的抗菌效率(图3E-F)。生物膜一旦建立，细胞外基质的存在使生物膜难以被抗菌剂穿透，从而表现出耐药性。最后，还研究了在不同纳米材料的挑战下根除另一种牙周炎相关病原体具核梭杆菌的已建立生物膜。如图S16所示，结果与牙龈卟啉单胞菌的结果一致，表明/ICG表现出对生物膜形成的有利干扰和成熟生物膜的分散，无论细菌种类如何。
临床上，牙周病通常由龈下菌斑引发和诱发，龈下菌斑由多种菌斑的聚集和共同粘附组成，而不是单一病原体。因此，为了模拟牙周生物膜，引入S. gordonii以建立多物种生物膜以进一步评估生物膜辐射。首先，在图4A中通过FISH研究了多物种成熟生物膜。在FISH 3D图像中，S. gordonii呈绿色；F. ucleatum呈蓝色，P. gingivalis呈红色。细菌组成比和平均厚度变化如图4B和S17F所示。在图S17A-S17E中分析了已建立的生物膜的整个生物体积内不同微生物的逐层分布。由于局部厌氧微环境，对照组的厌氧菌、具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌数量较多。牙龈卟啉单胞菌似乎对ROS更敏感，与其他两个物种相比急剧下降(从GNRs@SiO2组的56%到组的17%)。包括牙龈卟啉单胞菌在内的严格厌氧菌通过厌氧代谢存活下来，这取决于自由基化学和低电位金属中心。从本质上讲，这些催化位点容易受到分子氧和ROS的直接毒害，从而导致ROS对牙龈卟啉单胞菌具有很高的杀伤效率。此外，牙龈卟啉单胞菌被认为位于多物种生物膜的顶部，从而增加了纳米颗粒与微生物接触的可行性。组的细菌组成比与对照组相似(图4B)，但CFU显著降低(图S17G-S17H)，表明对所有种类的NO具有广泛的杀菌作用。这种非选择性杀菌作用是通过改变细菌膜和蛋白质硫醇的亚硝化和金属中心的亚硝基化作用实现的。连同ICG对ROS的选择性杀伤和NO对气体治疗的广泛打击，/ICG纳米平台表现出优异的抗生物膜功能，多物种生物膜的CFU减少约4 log(图S17)。
接下来，我们通过TEM监测了NPs处理后三种细菌的状态。图4C中，对照组细菌形态正常，几乎没有死菌，不同种类的细菌通过菌连。在aPDT/气体治疗组中，视图中的细菌总数随着死亡细菌数量的增加而减少。此外，很少检测到不同细菌之间的菌毛连接，细胞壁破裂，内容物泄漏。在/ICG处理后，由于aPDT、PTT和气体治疗的三重功能，大多数细菌表现出变形形态。有趣的是，发现NP紧密嵌入细菌细胞壁而不是细胞内存在。当由NIR光触发时，这种紧密接触将最大限度地发挥NPs的作用，并具有协同抗菌作用。在图S18中还研究了三种生物膜的SEM图像。对照组生物膜厚而致密。在所有抗生物膜组中，处理后的细菌表面都可以观察到膜凹陷。此外，在和/ICG组中都可以检测到明显的生物膜扩散和渗漏。
牙龈卟啉单胞菌作为牙周炎中的优势菌，可以影响共生菌和宿主免疫系统，导致细菌负荷和炎症增加。通常，致病性是由细菌附着在宿主细胞上引起的。之后，牙龈卟啉单胞菌可分泌大量的毒力因子，包括蛋白酶、内毒素等代谢物，破坏牙周病。本研究对牙龈卟啉单胞菌的相关粘附素分子基因(菌毛fimA、血凝素HagA和HagB)和毒力因子基因(PPAD、Kgp、RgpA和RgpB)进行了研究。这些因子基因可能的致病机制如图4D所示。如图4E所示，相关粘附素分子fimA、HagA和HagB的mRNA表达量分别从对照组的100%下降到NPs组的72.2%、45.2%和50.3%，表明增加温度胁迫对黏附素有正向的下调作用。据报道，较低的温度会增加fimA启动子活性，而较高的温度会降低血凝活性，从而影响细菌的粘附以调节毒力。/ICG组和组相关粘附素分子fimA、HagA和HagB基因表达的进一步降低主要归因于氧化应激或亚硝化应激。aPDT产生的ROS会导致DNA和蛋白质发生不可逆的氧化损伤。同时，亚硝化应激可能导致蛋白质上的DNA脱氨和硫醇亚硝化。因此，在/ICG NPs组中发现了对粘附素分子fimA、HagA和HagB基因表达的最大抑制。此外，PPAD、Kgp、RgpA、RgpB等毒力蛋白mRNA水平如图4E所示。作为一种来自牙龈卟啉单胞菌的非蛋白水解酶，PPAD可以与Rgps协同灭活几种血浆成分，使牙龈卟啉单胞菌持续存在于牙周袋中。同时，PPAD还可以瓜氨酸化Kgp和RgpA等毒力蛋白，促进细菌粘附牙龈细胞，进一步激活PGE2途径，影响宿主的免疫系统。本研究发现毒力蛋白如PPAD、Kgp、RgpA和RgpB的mRNA水平对温度胁迫不太敏感。与对照组相比，组PPAD、Kgp、RgpA基因表达无明显差异(p 0.1)。然而，在/ICG组和组中检测到Kgp、RgpA和RgpB mRNA表达显著降低，表明ROS和NO对细菌毒力有抑制作用。同样，/ICG的毒力因子基因表达最少，尤其是PPAD，因此可能会降低细菌粘附，正向调节宿主免疫。
牙周细菌提取物用于刺激巨噬细胞的促炎状态。培养6 h后，实验组接受不同纳米药物的NIR照射(808 nm，1 W cm-2，5 min，每天三次)(图5A)。/ICG处理对NLRP3炎症小体活化和NF-κB通路调节免疫反应的抑制作用是通过相关基因的表达和蛋白的表达来确定的。值得注意的是，在细菌攻毒后的炎症控制中，促炎细胞因子如IL-1β、IL-6、iNOS和TNF-α的基因表达升高。然而，用808 nm NIR辐照处理/ICG会显著降低这种增加(图5B)。此外， NLRP3炎症小体成分NLRP3和Caspase-1的mRNA表达低于炎症对照组，与对照组(无细菌刺激)相似。免疫荧光染色和蛋白质印迹反映了细胞内蛋白质水平(图5C和D)。如图5C所示，与处理组相比，炎症对照组显示出较强的免疫荧光，表明其促炎细胞因子和炎症小体成分的高表达。此外，蛋白质印迹结果定量证实，处理后NLRP3、Caspase-1和IL-1β的表达被显著抑制(p 0.0001)(图5E)，表明NO可以影响组分表达，从而阻碍炎症小体的组装。此外，在NF-κB/p65亚基易位实验中，治疗组的阳性细胞计数明显低于炎症对照组，证明/ICG NPs可以抑制NF-κB/p65亚基易位(图S19)。图5F详细描述了解释上述结果的可能机制。
在牙周炎中，牙周病原体表面的病原体相关分子模式与牙龈上皮细胞上的模式识别受体结合，诱导先天免疫反应，释放促炎细胞因子。同时，NLRP3炎症小体与牙周病的进展密切相关。NLRP3炎症小体的激活是一个炎症过程，由炎症小体成分NLRP3、caspase 1和pro-IL-1β的转录上调以及NLRP3翻译后修饰的诱导引发。据报道，NO可以通过NLRP3活性位点的硫醇亚硝基化来改变炎症小体的组装。同时，发现NLRP3的这种亚硝基化抑制了IL-1β的产生。此外，外源NO被证实可诱导IKKβ和p65的S-亚硝基化，抑制NF-κB途径。因此，上述体外实验结果表明，具有NIR响应性NO生成的/ICG可以轻松又有效地降低炎症小体相关成分的活化并抑制NF-κB通路，从而抑制炎症小体激活，改善局部炎症状态。
为建立牙周炎大鼠模型，在下颌前牙的颈缘周围放置结扎线，同时局部注射牙龈卟啉单胞菌。一周后，连续三天在近红外照射下用不同的纳米药物处理。随后对局部炎症状态进行了各种调查。体内实验的整个过程如图6A所示。首先评估了/ICG NPs在体内的光热效应。如图6B所示，/ICG NPs的温度在10 min NIR照射后迅速升高到43 °C。这一观察结果表明，/ICG纳米平台可以精确地限制在牙周炎症部位，并且可以响应近红外光触发的局部表面等离子体共振。随后，进行体内荧光成像以了解/ICG NPs治疗牙周炎症的疗效(图6D-G)。炎症对照组在感染部位呈现出最广泛的荧光区域和最强的荧光信号。由于aPDT/PTT和NO的三重抗菌作用和NO的抗炎作用，/ICG组显示出最低的荧光面积和强度，仅次于空白对照。炎性对照组局部牙龈组织呈水肿、发炎质地。而通过/ICG和的治疗，这种牙周症状得到缓解。有趣的是，/ICG组无显著的牙龈肿胀，这与空白对照组极为相似(图6H)。局部牙龈的表现符合牙龈边缘周围的细菌CFU计数(图6H)。如图6I所示，治疗后，不同组的CFU计数呈现不同程度的降低。其中，与炎症对照组相比，/ICG组的CFU减少量最大，CFU减少量超过1.5 log。有必要注意一下的是，CFU下降的程度不如体外结果显著，这可能是受复杂的口腔微环境和原生菌群的影响。因此，局部炎症的缓解可能是由于局部细菌菌落减少所致。经有效治疗后，大部分生物膜被aPDT、PTT和气体治疗的三重功能根除。先前的研究表明，NO可以作为炎症调节因子，通过将细菌数量减少到正常水平来促进伤口愈合过程。然而，当细菌受损时，包括碎片、细菌DNA流出和ATP在内的损伤相关分子模式(DAMP)会放大炎症。相反，NO可以调节免疫，减少DAMPs引起的炎症损伤。此外，据报道，NO还可以调节中性粒细胞附着在内皮的迁移和附着，以及在伤口愈合过程中协调白细胞募集。因此，基于NO的气体疗法有望通过对抗细菌感染和缓解临床炎症来辅助aPDT/PTT，从而将局部微环境转变为再生状态，从而进行快速有效的治疗。
通过H&E染色对牙龈组织进行组织学评估以分析炎症细胞的密度。图7A显示浸润的炎症细胞，包括中性粒细胞和巨噬细胞在炎症对照组中聚集在一起。而在其他组中，较少的炎症细胞被招募到炎症部位。根据图7B的统计分析，/ICG NPs组在实验组中炎症细胞数量最少，表明其对体内局部炎症的抑制作用相对较强。
接下来通过Masson染色检查了炎症部位的胶原降解(图7C)。在空白对照组中发现了致密有序的胶原原纤维(蓝色染色)。而在炎症对照组中，大多数胶原原纤维呈现出红色染色的降解状态。空白对照、和/ICG NPs组在胶原降解方面没有显著差异(图7D)。病原体分泌的胶原酶可以破坏牙周组织中的胶原纤维。外源性NO可刺激I型胶原蛋白表达，而I型胶原蛋白是牙周韧带胶原纤维的主要成分。在NO释放环境下，干细胞可分泌促再生因子和免疫调节因子进行组织修复。此外，释放NO的纳米平台能够最终靠促进角质形成细胞增殖和分化来加速伤口愈合和上皮化。随后，通过免疫组织化学染色(IHC染色)和实时PCR检测典型的牙周炎相关促炎因子IL-1β和TNF-α，以再次确认NO治疗的抗炎特性(图7E-8 H)。阳性细胞的表达趋势与胶原降解的结果一致(图7E和F)。IL-1β可刺激牙龈成纤维细胞降解胶原，同时释放和激活各种基质金属蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。同样，研究发现TNF-α可抑制HGF中的胶原基因转录和胶原合成。因此，NO可以有效抑制这两种促炎因子的表达，从而抑制炎症，减少胶原降解，最终保护牙周组织，促进牙周病的愈合。
(A)实验进度意图。(B) NIR照射下的代表性实时热图像(1 W cm−2,10 min)和(C)相应的温度曲线。(D,E)不同NP治疗后牙周感染部位ROS水平的体内荧光成像。(F,G)通过荧光面积和平均荧光强度比对局部ROS水平进行相应的量化。(H)在琼脂板上培养从牙龈组织中分离出的细菌的口腔内照片和菌落。琼脂板左上角的数字代表稀释因子(I)每个样品的相对存活细菌数百分比。n = 3，*p 0.05，**p 0.01，***p 0.001，****p 0.0001，ns，不显著。
本研究成功设计了一种三功能NO纳米发生器/ICG NPs，协同aPDT/PTT/气体疗法在牙周病模型中对抗生物膜并抑制炎症。一方面，aPDT与PTT联合使用可通过改变细胞膜通透性，有效杀灭牙周细菌，阻止致病性生物膜的形成。另一方面，这种具有NIR响应性NO生成的纳米平台可以分散和根除单物种和多物种生物膜中的成熟生物膜，CFU降低约4-log。重要的是，牙周病原体的粘附素分子基因和毒力因子基因也显著降低，因此导致致病性较弱。同时，NO的释放不仅通过抑制NF-κB通路，还通过阻断NLRP3炎症小体激活，减少促炎细胞因子的分泌，从而调节炎症免疫反应，减少组织损伤。体外和体内实验均表明，该纳米平台在防止生物膜形成、成熟生物膜的分散和减轻炎症反应方面具有优异的性能。总体而言，本研究从生物膜消除和炎症控制的角度为牙周病的临床治疗提供了一种策略，并有可能扩展到其他难治性细菌感染疾病，特别是深部部位。