三聚氰胺免疫层析试纸检测的新方法研究

  10月15日，国家质检总局、国家标准化管理委员会批准发布《原料乳中三聚氰胺快速检测液相色谱法》（GB/T22400-2008）国家标准。目前，全国相关质检机构依据该标准，正在有条不紊地对婴幼儿配方乳粉、普通乳粉和其他配方乳粉，以及液态奶实行严格检测。与此同时，一些科研院所也迅速开展了三聚氰胺检测方法的研究。前不久，武汉工业学院生物与制药工程系副主任刘志国等3名博士对外宣布，已研制开发出3种家用和工业检测三聚氰胺的快速检测法。只需将试纸插入稀释的奶制品中，不到10分钟就可检测出有无三聚氰胺，成本在20～50元之间，普普通通的家庭皆可使用。

  那么，究竟这是怎样的检测的新方法呢？本刊编辑近日连线位专家，并特约了相关检测论文，在此与广大检验检测专业技术人员交流探讨。

   摘 要研究免疫层析试纸方法快速检测样品三聚氰胺残留。采用戊二醛法和重氮法分别合成三聚氰胺-明胶和三聚氰胺-牛血清白蛋白，作为免疫抗原和检测抗原。按常规方法制备抗三聚氰胺多克隆抗体并用胶体金标记。制作免疫层析试纸，通过观察金标抗体在试纸条上检测线的呈色现象，判断样品中三聚氰胺的残留量。根据结果得出，本方法可在15分钟以内完成检测，检测限为1.0μg/mL，可应用于牛奶等样品中三聚氰胺残留的快速检测。

   三聚氰胺（英文名Melamine），简称三胺，又叫2 ,4 ,6-三氨基-1,3,5-三嗪、1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺、2,4,6-三氨基脲、蜜胺、三聚氰酰胺、氰脲三酰胺，是一种三嗪类含氮杂环有机物，是重要的氮杂环有机化工原料。在食品制造业中，因需要测定食品的蛋白质含量，而直接测量蛋白质技术上很复杂，所以一般会用凯氏定氮法测定蛋白质含量，即通过测定食品中氮的含量来间接推算蛋白质的含量。由于三聚氰胺与蛋白质相比含有更多的氮原子，所以添加在食品中的三聚氰胺可以造成食品蛋白质含量较高的假象，因而被不法商贩所利用。三聚氰胺被摄入人体后，通过小肠吸收进入血液循环并最终进入肾脏，形成肾结石，尤其对于哺乳期的婴儿，更容易造成结石。

   三聚氰胺的检测目前主要是采用仪器检测的方法。主要方法有：GC-MS法、Spectra-Quad在线检测、超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法、反相高效液相色谱法、高效液相色谱-二极管阵列法、高效液相色谱法(HPLC)、高效液相色谱-四极杆质谱联用、固相萃取与高效液相色谱联用、液相色谱串联质谱法(LC-MSMS）等。这些仪器方法价格昂贵，且方法操作复杂，需受过专门训练的人员才能操作，而且存在着适合使用的范围窄、设备昂贵、成本高等问题。目前还没有一种特异性强、灵敏度较高、且简单易操作方便、适宜快速的现场检测和大规模普查要求的乳制品中三聚氰胺检测方法。

  为解决现存技术的不足，笔者进行了快检方法的研究，并提出了一种特异性强、灵敏度较高，且简单易操作方便，对样品经过简易地处理即可检测的三聚氰胺快速试纸检测的新方法，为开展三聚氰胺快速现场检测和大规模普查提供了方便。

  采用戊二醛做交联剂，使明胶载体和小分子半抗原三聚氰胺的氨基以共价键连接来合成免疫全抗原[1，2]。将透析后的淡黄色免疫抗原三聚氰胺-明胶溶液冷冻干燥备用。采用常规免疫程序免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体，免疫沉淀实验检测抗体效价，两个月后采用颈动脉取血法收集抗血清，硫酸铵法纯化抗体，0.01mol/LPBS（pH7.2）透析直至透析外液与氯化钡反应无沉淀为止，加入终浓度为0.01％的叠氮钠，分装后置-70℃低温保存。

  用重氮法[3]合成三聚氰胺-牛血清白蛋白（作为包被抗原），用于间接酶联免疫吸附实验[4，5]，测定三聚氰胺特异性抗体的效价。具体方法是，用包被液（0.15gNa2CO3，0.29gNaHCO3，0.1gNaN3，加蒸馏水至100mL，用1mol/LHCl调pH值为9.6）将三聚氰胺-牛血清白蛋白稀释成1μg/mL的溶液，取100μL包被酶标板，4℃过夜（约15h）。无菌蒸馏水冲洗4次，然后，每孔加200μL封闭液（2.15gNa2HPO4·12H2O，0.372gEDTA·Na2·2H2O，1g牛血清白蛋白，0.1gNaN3，加蒸馏水至100mL），于37℃封闭2h。无菌蒸馏水冲洗4次。将抗血清系列稀释（稀释液0.01mol/LpH7.4 PBS，0.1%牛血清白蛋白，蒸馏水配置），各取100μL加入各孔，置37℃1.5h。同时设重复、阴性对照及空白对照。无菌蒸馏水冲洗4次。每孔加100μL1：10000稀释的HRP-羊抗兔抗体，置37℃1.5h。无菌蒸馏水冲洗4次。每孔加入底物液（0.51g柠檬酸，1.84gNa2HPO4·12H2O，加蒸馏水至100 mL，临用前加邻苯二胺40 mg和30% H2O2 0.15mL）100μL，置37℃10～15min。每孔加50μL 2mol/L终止液（2mol/L硫酸）终止反应3～5min。酶标仪测其OD492nm。

   取100mL三重蒸馏水，加入1mL 1%氯金酸，置微波炉的中高火加热沸腾约4min，然后加入3 mL1%柠檬酸三钠溶液，继续加热，溶液颜色由无色转为兰色，再变为紫色，最后变为橙红色时停止加热。冷却后进行透射电镜扫描和紫外扫描，鉴定胶体金质量及颗粒大小[6]。

   取10mL胶体金溶液，加入35μL10%的K2CO3溶液调节pH值至7.5，然后加入100μL 3mg/mL的上述抗体溶液，室温摇动15min，然后加入终浓度为0.2%的聚乙二醇20，000和终浓度为1%的牛血清白蛋白，继续搅拌15min，然后置4℃冰箱2h，于4℃，10000rpm离心20min，在管底可以看见流动的金标抗体沉淀，弃上清，然后用稀释液（含8%蔗糖，0.05%吐温-20，0.5%牛血清白蛋白的pH值7.4的0.01mol/LPBS）恢复到原体积，于4℃，10000rpm离心20min，弃部分上清至金标抗体恢复到原体积的1/10，即1mL，放置在4℃冰箱备用[7]。

   1-样品垫、2-金标垫、3-硝酸纤维素膜、4-检测线;制作时，在支持板（如PVC板）上依次粘贴有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫等。在硝酸纤维素膜上划线条三聚氰胺检测用抗原线μg/mL）作为检测线条羊抗兔IgG线μg/mL。然后依次粘贴样品垫、金标垫、吸水垫，即组合为三聚氰胺的快速检测试纸。

  检测时，试纸水平放置，于样品垫滴加100μl水溶液样品，5～10min内观察颜色。若检测线呈现红颜色，表明样品为阴性；若检测线不显色，表明样品为阳性（三聚氰胺含量为1mg/kg以上）。无论样品中三聚氰胺含量如何，参考线应该显色，若参考线不显色，表明试纸失效。对于较为黏稠液态乳制品，则需要做适当稀释处理或沉淀蛋白质。固态乳样品，用PBS溶液将样品溶解并做适当稀释后按液态乳制品相同方法检测。

  制作好的试纸水平放置，将实验溶液配制成不同浓度。分别在样品垫中滴加实验溶液100μl，溶液通过毛细管吸附作用向样品垫方向挪动，5～10min后观察结果，如图2所示。

  图2结果为，随着样品中三聚氰胺浓度的增加，检测线颜色变浅，通过调节试纸中金标抗体和检测抗原的用量，使样品浓度为1μg/mL的溶液在检测线位置不出现红色线条，此即为阳性；当样品浓度低于1μg/mL时，检测线呈现不同深浅的颜色，浓度越低，颜色越深。

  本文应用胶体金免疫层析实验方法成功研制出三聚氰胺测试试纸，本方法具有方便、简单、快速的特点。为食品中三聚氰胺的快速检测提供了一种方便实用的方法。

   （作者单位：武汉工业学院生物与制药工程系）

   所检乳制品均符合三聚氰胺临时管理限量值规定

  日前，国家质检总局进行了第18次婴幼儿配方乳粉、普通乳粉和其他配方乳粉以及第25次液态奶三聚氰胺抽样检测。其中，抽检到伊利、银桥等公司在内的5个省（自治区、直辖市）生产的14个品牌68批次婴幼儿配方乳粉，抽检到伊利、古城、银桥等公司在内的9个省（自治区、直辖市）生产的27个品牌106批次普通乳粉和其他配方乳粉，从33个城市抽检到蒙牛、伊利、光明、三元、完达山、卫岗、银桥等公司在内的24个省（自治区、直辖市）生产的87个品牌773批次的酸乳、巴氏杀菌乳、灭菌乳等液态奶，均符合相应的三聚氰胺临时管理限量值规定。

  截至目前，质检总局对9月14日以后17个省（自治区、直辖市）生产的82个品牌1814批次婴幼儿配方乳粉进行了抽样检测，对9月14日以后25个省（自治区、直辖市）生产的186个品牌2533批次普通乳粉和其他配方乳粉进行了抽样检测，从66个城市抽检了28个省（自治区、直辖市）生产的202个品牌13677批次液态奶，均符合相应的三聚氰胺临时管理限量值规定。详细名单可登录质检总局网站查阅。

  国家质检总局要求各大商场、超市要张贴检查合格企业及产品名单，设置放心乳品柜台，保障市场充足供应优质安全乳品。

  在瑞典，农场运交的每一批牛奶都要进行采样，全部样本都被送往原料奶检测实验室。如果某个农场主生产的牛奶未能达到标准，该农场主将可能被禁止向乳品公司可以提供牛奶。瑞典还实行“农场质量保证计划”，计划内的农场里，奶农不会使用化学制剂在农场里驱除昆虫、消灭野蘑菇和杂草，而是让奶牛生长在自然平衡的环境中。奶制品企业的相关资深顾问天天都会轮流到农场仔细检查每一批次的鲜奶是不是达到了生态食品认证的要求。

  加拿大联邦政府和省政府按《全国牛奶市场营销计划》协议，在汇集国内市场和出口市场需求的基础上，设定全国牛奶产量配额，并将配额分配给各省。

  各省也有各自相应的立法和管理条例，设立本省牛奶营销机构，授权其通过基于单个农场的生产配额体系进行牛奶供给管理。联邦政府管理省际和国际的乳制品贸易，对液体奶和在本省出售的乳制品的安全检验则由省政府负责。大多数液体奶工厂和较小的乳酪工厂，若其产品只在本省销售，其食品安全问题由省政府负责管理。其他大多数乳制品工厂则由联邦政府检查，确保他们合乎《加拿大农产品市场营销法案》的规定。

  德国奶业生产遵循以下原则：一、选择可靠奶源地。这些奶农养的奶牛、饲料等都有电脑系统控制。而且，养牛过程绝不添加任何化学剂。二、加工细节很重要，执行的是“欧盟生态奶粉标准”，营养的丢失很少，保留的营养成分就会多。三，所有婴幼儿配方奶粉均采用电子标签芯片全程管理，通过每罐奶粉的芯片，可准确了解该罐奶粉的产地、牧场、工厂、生产线、生产时间等信息，有效地保证了食品安全。据了解，德国的奶粉还要经过药品监督管理体系。因为德国规定，婴儿配方奶粉属于药品管制，一定要通过德国卫生部门的检测。

  目前巴西通行的食品检查程序一般是先选取样品，接着进行实验室分析。这些样品可能从生产厂商选取，也可能是直接从市场抽取。乳制品由巴西农牧业部下属的奶制品监察局负责抽查，样品一旦进入实验室做分析，就算进入司法程序。同时，如果食品类产品已在市场上销售，国家健康监督局也可对产品做评估，不合格的企业将被吊销生产许可证。

  美国食品药品监督管理局（FDA）日前发布的标准表示，三聚氰胺含量2.5ppm以下（即2.5毫升/公斤）不会对公众健康产生危险。

  目前，国际上被普遍接受的是日前美国食品药品监督管理局（FDA）发表的有关报告。FDA指出，除婴儿食品，普通食物中含有三聚氰胺和其类似物质在2.5毫克/公斤（即2.5ppm）以下，不会对公众健康产生危险，不过FDA强调婴儿食品中则不应该含有任何剂量的三聚氰胺。据悉，欧洲、澳大利亚和新西兰等许多国家和地区也普遍采用2.5毫克/公斤为最低检出值。而在中国香港，当地标准是奶类及供36个月以下婴幼儿和孕妇以及授乳女性食用食物，三聚氰胺的最高浓度不得多于1毫克/公斤，其他食物可容许的最高浓度为2.5毫克/公斤。

   日本：“肯定列表制度”强化食品中农业化学品残留管理

  在日本的食品安全法中，突出的就是肯定列表制度。“肯定列表制度”是日本为加强食品中农业化学品(包括农药、兽药和饲料添加剂)残留管理而制定的一项新制度。该制度要求，食品中农业化学品含量不允许超出最大残留限量标准；对于未制订最大残留限量标准的农业化学品，其在食品中的含量不允许超出“一律标准”，即0.01毫克/公斤。

  日本的“肯定列表制度”设定了进口食品、农产品中也许会出现的799种农药、兽药和饲料添加剂的5万多个暂定限量标准，对涉及264种产品品种类型同时规定了15种不准使用的农业化学品。

  2008年10月15日，韩国食品药品管理局发布了转基因食品标签标准修订提案。提案制定了允许“无转基因”标签的规定；澄清了转基因食品的定义以扩大必须有转基因标签的项目。

  拟对食品标签标准作出如下修订以减少对食品标签的限制并向消费的人提供更多信息：撤销与韩语一起使用的外语字体大小规定；考虑到产品质量区别，通过允许企业设定“每份用量”，扩大“每份用量”的范围；将只允许特殊膳食使用的维生素和矿物质营养标签扩大到常规食品；允许婴儿配方等食品标明营养成分名称及含量，而不单单是营养参考值百分比。撤销了人参和红参标准说明。

  2008年6月6日，韩国制定食品标准与规范的修正案草案，修订与制定农产品内杀虫剂与食品内抗生素的最大残留限量MRLs;修订与制定茶内铅与镉的含量标准;及制定玉米及其粗加工(碾磨、切割等)产品内伏马菌素[fumonisin]的标准。